Next Generation Sequencing, Projekt ID 0114

Projektleiterin: Dipl.-Biol. Dr. rer. nat. Karin Mayer, Fachhumangenetikerin, Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin, Martinsried

Kurzfassung

In diesem Forschungsprojekt wird mittels Einsatz der Methode „Next Generation Sequencing“ eine weitere Möglichkeit zur Identifizierung der genetischen Ursache bei Patienten mit Tuberöser Sklerose gesucht, bei denen mit den bisher eingesetzten molekulargenetischen Methoden keine Mutation nachgewiesen werden konnte.

Auf einer ausgestreckten Hand liegt ein Stück DNA (Symbolbild)
Foto: Pixabay.com


Laufzeit

Die Förderung des Projektes wurde August 2010 (damals noch durch den  TSDeV) genehmigt, positive Votum der Ethikkommission der Bayerischen Landesärztekammer lag in 2011 vor.

Seit Dezember 2014 fördert die Deutsche Tuberöse Sklerose Stiftung das Forschungsprojekt.

Fördermittel

Das Forschungsprojekt hat ein Gesamtvolumen von 30.000,- €. Der TSDeV hat davon 16.666,00 € übernommen. Die Stiftung trägt die restlichen Projektkosten in Höhe von 13.334,00 €.

Dipl.-Biol. Dr. rer. nat. Karin Mayer



Projektbeschreibung

Großes Laborgerät (Zentrifuge) wird von einer Person im weißen Kittel bedient, Symbolabbildung
Foto: Pixabay.com

Dieses Projekt startete bereits im Jahr 2010. Es wurde zunächst vom Tuberöse Sklerose Deutschland e. V. mit 16.666,00 € gefördert.

Nach der Entdeckung der genetischen Ursache der Tuberösen Sklerose (TSC), welche sich in Form von Mutationen in den Genen TSC1 und TSC2 zeigt, hat sich in der Forschung Einiges getan und damit auch in der genetischen Labordiagnostik. Diese wird zum einen eingesetzt, wenn aufgrund der klinischen Anamnese keine exakte Diagnose zum Vorliegen der TSC getroffen werden kann, zum anderen wenn sich von der Krankheit betroffene Personen mit der Gründung einer Familie auseinandersetzen bzw. wenn weitere Familienmitglieder evtl. als Träger der TSC in Betracht kommen. In allen Fällen hilft die genetische Labordiagnostik weiter, weil sie in vielen Fällen eine Krankheitsursache erkennt und darüber hinaus eine einzelfallgerechte medizinische Beratung ermöglicht.

Obwohl in der Forschung in den letzten Jahren große Fortschritte erreicht werden konnten, befindet sich die Forschung hinsichtlich der TSC immer noch im Bereich der Grundlagenforschung. Seit 1997 sind nunmehr beide TSC-Gene identifiziert und können molekulargenetisch auf Mutationen untersucht werden. In beiden TSC-Genen wurden weltweit zwischenzeitlich über 1.200 unterschiedliche krankheitsverursachende Mutationen identifiziert. Die Mutationen können alle Bereiche beider Gene betreffen und sie können sich in allen unterschiedlichen Mutationstypen äußern. Es wurde festgestellt, dass der Anteil von TSC2-Mutationen mit 60-80 % insgesamt viermal häufiger ist als der von TSC1-Mutationen mit 20-30 %. Im TSC2-Gen stellen sich die Verluste größerer Genbereiche mit ca. 6 % aller Mutationen dar, wohingegen die Verluste im TSC1-Gen nur 0,5 % betragen.

Aufgrund der Vielfalt der möglichen Mutationen und deren variabler Lokalisation ist es bei der Suche nach Mutationen beider Gene erforderlich, beide Gene in ihrer gesamten Länge auf alle möglichen Mutationstypen mit unterschiedlichen Methoden zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Analyseverfahren ist momentan eine Identifizierung der krankheitsverursachenden Mutation bei bis zu 85 % der Patienten mit der klinisch gesicherten Diagnose TSC möglich. Anders verhält es sich bei Patienten, welche nur einzelne Symptome der TSC aufweisen und bei denen somit nur eine gewisse Wahrscheinlichkeit oder Möglichkeit einer TSC-Erkrankung vorliegt. In diesen Fällen liegt die Mutationserfassungsrate nämlich nur bei 10 - 60 %.

Bei allen derzeit üblichen Untersuchungsmethoden wird zunächst aus den weißen Blutzellen (Leukozyten) DNA isoliert, welche mit unterschiedlichen Methoden auf Veränderungen analysiert wird. Veränderungen können sein: Austausch oder Verlust einzelner Basen oder DNA.

blau eingefärbte DNA-Stränge
Foto: Pixabay.com

Bei den diagnostischen Routinemethoden zur Analyse von Mutationen handelt es sich um die nachfolgend aufgeführten:

 

1.   Die DNA-Sequenzierung der Protein-codierenden Bereiche beider TSC-Gene nach der Kettenabbruchmethode (Methode nach Sanger, erstmals beschrieben 1977) ist dabei die zuerst durchgeführte Methode, mittels welcher ca. 90 % aller TSC-Genmutationen erfasst werden können.

2.   Diese wird ergänzt durch die Multiplex Ligation Dependent Probe Amplifikation (MLPA, verfügbar seit 2005), welche der Untersuchung der größeren Stückverluste oder Zugewinne dient. Diese Stückverluste oder Zugewinne liegen bei ca. 0,5 % im TSC1-Gen und bei bis zu 6 % im TSC2-Gen vor.

3.   Daneben gibt es noch die molekularzytogenetische Analyse (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, FISH), welche die Verluste oder Rearrangierungen ganzer Gen- oder Chromosomenbereiche untersucht, indem man die einzelnen Chromosomen darstellt und den entsprechenden Bereich auf Chromosom 16 mit einer Fluoreszenz-Sonde markiert.

4.   Seit 2007 haben sich neue Hochdurchsatz-Methoden zur Sequenzierung eines humanen Genoms rasant weiterentwickelt, welche sogar die Geschwindigkeit der Weiterentwicklung von Speichermedien der IT-Branche übertreffen. Diese neuen Methoden werden unter dem Begriff „Next Generation Sequencing (NGS)“ zusammengefasst. Mittels der NGS-Methoden können eine hohe Anzahl von DNA-Molekülen parallel sequenziert werden. Die Besonderheit der NGS besteht in ihrem hohen Durchsatz (die in einer bestimmten Zeit durch einen Apparat oder eine Anlage fließende Stoffmenge), welcher es ermöglicht, 10 Gigabasen oder mehr an Sequenz in einem einzigen Lauf zu erzeugen. Es besteht dabei die Möglichkeit die Anreicherung und Vervielfältigung auf diejenigen Gene des Patienten zu beschränken, welche aufgrund der Verdachtsdiagnose in Betracht kommen könnte. Der entsprechende Zeitaufwand für die Sequenzierung ist damit erheblich gesunken, wobei die Anforderungen an die Interpretation der erlangten Daten quasi in gleicher Weise gestiegen ist und es immer noch gewisse Unwägbarkeiten im Rahmen der Sequenzierung gibt.

 

Für die evtl. Betroffenen bedeutet dies aber höchstwahrscheinlich einen riesengroßen Schritt nach vorne, da hierdurch aller Voraussicht nach weitere Mutationen erkannt werden können, welche mit den bisherigen Methoden nicht gesehen und damit auch nicht nachgewiesen werden konnten.

 

Weitergehende Informationen zu den einzelnen Next Generation Sequencing Methoden können Sie auf der Homepage des Zentrums für Humangenetik und Laboratoriumsdiagnostik (MVZ) in Martinsried einsehen:

http://www.medizinische-genetik.de/index.php?id=next-generation-sequencing


Grundlagenwissen

Korb mit Proben-Reagenzgläsern (sog. Laborröhrchen) - Symbolfoto
Foto: Pixabay.com

Die Tuberöse Sklerose ist eine genetisch bedingte Krankheit, welche durch Veränderungen (Mutationen) von Genen beruht. In den Genen werden die Erbinformationen gespeichert. Ein Mensch verfügt über ca. 30.000 Gene, wobei man sich ein Gen als einen Abschnitt auf der DNA (aus dem Englischen „desoxyribonucleinacid“ bzw. DNS im Deutschen „Desoxyribonucleinsäure“) vorstellen kann.

Alle Merkmale, welche ein Lebewesen ausmachen, lassen sich auf die Erbsubstanz DNA zurückführen. Im Inneren eines jeden Zellkerns liegt der DNA-Faden, welcher wie eine Strickleiter aufgebaut ist und sich schraubenförmig um die eigene Achse dreht (sog. Doppelhelix). Die Leiterholme (Rückgrat der Leiter) bestehen abwechselnd aus dem Zucker „Desoxyribose“ im Wechsel mit Phosphat. Die Leitersprossen sind aus vier organischen Basen gebildet: Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) und Guanin (G), wobei immer nur A und T, sowie C und G ein Pärchen bilden. Jedes Gen verfügt über eine andere Abfolge der Basen, welche über die Ausprägung eines Merkmals, wie beispielsweise Haarfarbe, entscheiden. Diese spezielle Abfolge der Basen ist wiederum entscheidend für den Aufbau von Proteinen (Eiweiß). Es sind also spezielle Eigenschaften des Menschen an speziellen Stellen der DNA verortet.

Die DNA kontrolliert alles, was in der Zelle vorgeht, auch die Zellteilung, welche ab einer bestimmten Größe der Zelle erfolgt. Zuvor wird der Erbfaden (DNA) kompakter und er verdrillt sich stark, d. h. er verdreht sich immer mehr, so dass man die DNA als Chromosom erkennen kann. Jeder Mensch hat 46 Chromosomen in jedem Zellkern. Es handelt sich um jeweils zwei gleiche Paare, nämlich 22 Paare aus sog. homologen Chromosomen (oder auch Autosomen genannt) plus 2 Geschlechtschromosomen (XX bei der Frau und XY beim Mann). Um die wissenschaftliche Darstellung zu erleichtern, wurden diese Chromosomen inkl. der dazugehörigen Basen durchnummeriert.

Vereinfacht dargestellt, kann man dies dem nachfolgenden Schaubild entnehmen:    

Schaubild zeigt Zellteilungsschema und Entstehung von Mutationen als Fehler bei der Reproduktion der DNA
Schaubild aus Dr. med. Carmen Gallitzendorfer "Was ich schon immer über TSC wissen wollte", Herausgeber: Tuberöse Sklerose Deutschland e.V.

Vor einer Zellteilung muss die DNA kopiert werden. Hierzu werden zuerst die Chromosomen verdoppelt, welche anschließend bei der Zellteilung aufgeteilt werden.

Genau anders herum muss es sich verhalten, wenn eine Eizelle befruchtet wird, da diese Erbinformationen des Vaters und der Mutter zu gleichen Teilen enthält. Würde dies nicht erfolgen, so hätte ein Kind 92 Chromosomen. Die Chromosomenzahl wird daher vor der Befruchtung in den Keimdrüsen (dem Hoden bzw. den Eierstöcken) halbiert.

Bei beiden Vorgängen können Fehler im „Abschreibevorgang“ passieren. Wenn eine Base (Leitersprosse) beispielsweise in der falschen Reihenfolge gespeichert wird, zieht dies eine Veränderung der Erbfolge nach sich. Wie oben bereits dargestellt wurde, sind die Basen verantwortlich für den genetischen Code, welcher beim Aufbau von Proteinen, also Eiweiß, eine wichtige Rolle spielt. So könnte ein bestimmtes Eiweiß mit einer ganz spezifischen Funktion nicht mehr korrekt hergestellt werden. Dieser Fehler würde sich danach in einer genetischen Erkrankung wiederspiegeln.

 

Bei der TSC können zwei Gene verändert sein, welche als TSC1- und als TSC2-Gen bezeichnet werden. Das TSC1-Gen befindet sich auf dem 9. Chromosom an Genlocus q34 und das TSC2-Gen auf dem 16. Chromosom an Genlocus p13. Diese beiden Gene beinhalten die entsprechenden Bauanweisungen für die beiden Eiweißkörper „Hamartin“ im TSC1-Gen und „Tuberin“ im TSC2-Gen, welche im Zellplasma einen Komplex (Hamartin-Tuberin-Komplex) bilden, der die Zellteilung und die Differenzierung zu unterschiedlichen Zelltypen steuert und damit entscheidenden Einfluss auf das Zellwachstum hat. Die beiden Gene TSC1 und TSC2 sind in jeder Körperzelle zweimal vorhanden, nämlich in Form einer Kopie vom Vater und einer von der Mutter. Der Hamartin-Tuberin-Komplex fällt dann aus, wenn eines dieser beiden Eiweiße in einer Zelle nicht mehr gebildet werden kann. Dies geschieht dann, wenn beide elterlichen Gene an derselben Stelle, also beispielsweise das TSC1-Gen von Vater und Mutter oder das TSC2-Gen von Vater und Mutter, durch eine Mutation inaktiviert werden. Ist nun die Information bzgl. der Zusammensetzung dieser Eiweiße fehlerhaft, wird der Hamartin-Tuberin-Komplex funktionsuntüchtig, was zur Folge hat, dass sich die Zellen ungehindert teilen können (Tumorenbildung) und eine unzureichende Differenzierung dieser betroffenen Zellen entsteht.

Schaubild mit der Wirkung der Proteine Hamartin und Suberin auf Zellteilung und Differenzierung
Quelle: Sandra Hoffmann, Dr. rer. nat. Karin Mayer "Leben mit TSC - Eine Krankheit mit vielen Gesichtern", Herausgeber: Tuberöse Sklerose Deutschland e.V.

Ist jemand an TSC erkrankt, so ist entweder das TSC1- oder das TSC2-Gen von einer Veränderung (sog. Mutation) betroffen. Eine solche Mutation wird mit einer Wahrscheinlichkeit von 50 % (in der Fachsprache: dominant) an die Nachkommen weitervererbt. Man nennt diesen Vorgang autosomal dominant, da es sich um Chromosomen der Nr. 9 und Nr. 16 handelt und sich bei Vorliegen einer TSC1- oder TSC2-Genmutation die mutierte Geninformation bei der Bildung einer Samen- bzw. Eizelle ggü. der gesunden durchsetzt. Weiterhin reicht die Inaktivierung einer der beiden elterlichen TSC-Genkopien für die Verursachung der Krankheit aus.

Solange das zweite elterliche Gen aber intakt ist, hat dies keine Funktionsausfälle zur Folge, weil die Produktion von Hamartin und Tuberin noch durch die Informationen des zweiten elterlichen intakten Genes gewährleistet ist. Sollte es jedoch im Laufe des Lebens zu einer zweiten Mutation kommen, welche das gesunde elterliche Gen betrifft und dieses inaktiviert, dann fällt die Bildung von Hamartin bzw. Tuberin und damit in Folge die Komplexbildung vollständig aus.

Bei zwei Dritteln der an TSC- Erkrankten entstand diese Mutation in einer elterlichen Keimzelle oder während der frühen Embryonalentwicklung neu. Dies wird bezeichnet als sog. Neumutation bzw. sporadischer Fall.

Spricht man von sog. familiären Fällen, so betrifft dies ca. ein Drittel der Erkrankten, in welchen die Mutation von einem der beiden Elternteile vererbt wurde. In Familien mit mehreren Betroffenen sind die Mutationen des TSC1-Gens und des TSC2-Gens gleich häufig, in sporadischen Fällen sind Mutationen im TSC2-Gen um ein Vierfaches häufiger anzutreffen als Mutationen im TSC1-Gen.

In diesem Zusammenhang soll ausdrücklich darauf hingewiesen werden, dass aus der klinischen Symptomatik im Einzelfall nicht auf das jeweilige TSC-Gen geschlossen werden kann. Ist im Einzelfall eine exakte Diagnose erforderlich, weil beispielsweise nicht genau diagnostiziert werden kann, ob TSC vorliegt, so wird man um eine genetische Diagnostik nicht umhinkommen.

Genau an diesem Punkt setzt unsere Forschung an, indem sie mittels der neuesten Methode Next Generation Sequencing untersucht, ob es nicht noch weitere für die TSC-Diagnostizierung hilfreiche (evtl. nunmehr offensichtliche) Mutationen auffinden kann.

Ausführliche Hinweise zu den genetischen Diagnosemöglichkeiten finden Sie im Informationsblatt Nr. 8 des Tuberöse Sklerose Deutschland e.V. und zur genetischen Beratung und Untersuchung des ungeborenen Kindes bei TSC im Informationsblatt Nr. 4. Die Informationsblätter können Sie unter www.tsdev.org bestellen bzw. herunterladen.